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1. 凡纳滨对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)可视化环介导等温扩增(LAMP) 技术方法的优化与应用
葛辉 吴建绍 杨章武 吴丽云 张哲 杜秀萍 洪伟 林克冰 林琪 林嘉铭 周宸
渔业研究    2021, 43 (4): 357-365.   DOI: 10.14012/j.cnki.fjsc.2021.04.002
摘要196)      PDF (3955KB)(375)    收藏
传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)作为对虾疾病的主要病原之一,能够感染多种对虾,对幼虾危害尤其明显,虽然死亡率不高,但可以引起对虾生长缓慢,造成巨大的经济损失,严重影响对虾养殖业持续健康发展。本文根据IHHNV病毒基因的保守序列,采用Primer Explorer V4软件设计6条LAMP特异性引物组合,建立了一种以环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)为基础的快速检测IHHNV的方法。对本研究的LAMP检测方法的敏感性和特异性进行分析,并将其灵敏度与实时荧光定量PCR、普通PCR检测方法进行比较。结果显示:LAMP检测方法在63℃恒温条件60 min内完成反应,阳性结果出现可视化的绿色,阴性结果颜色不发生变化;LAMP方法的最低检出限为10.3 copies/μL,灵敏度与荧光实时定量PCR相当,较常规PCR高。结果表明建立的LAMP方法适用于对虾IHHNV的现场快速检测。
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2. 推进福建省大黄鱼产品质量安全管理工作的对策与思考
杨求华 钟传明 周宸 张艺 廖碧钗
   2020, 42 (5): 519-526.  
摘要65)      PDF (1014KB)(346)    收藏
大黄鱼作为我国特有的地方性鱼类,随着养殖规模的扩大和养殖产量的增加,其产品质量安全问题也时有发生。为促进福建省大黄鱼产业健康可持续发展,本文通过走访调研相关企业,分析当前质量安全监管工作面临的新形势和新问题,对已取得的工作成效与经验进行归纳整理,并提出今后改善大黄鱼产品质量安全管理工作的对策,以期为促进福建省大黄鱼产业的高质量发展尽绵薄之力。
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3. 斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)病毒性神经坏死病毒的纯化分析及检测方法建立
葛辉 吴丽云 周宸 黄种持 吴建绍 郑乐云 林琪 杨求华 吴水清 王艺磊 林克冰
   2019, 41 (2): 96-105.  
摘要193)      PDF (3928KB)(560)    收藏
根据GenBank中已有的鱼类病毒性神经坏死病毒(NNV) RNA2基因序列,设计引物,从福建厦门具有典型NNV发病症状的斜带石斑鱼中克隆了RNA2基因的全长序列,并将序列提交到GenBank获得登录号为MF510920,命名为XMNNV。系统进化树分析结果表明XMNNV与RGNNV聚类在一起,与SJNNV、BFNNV和TPNNV等其他鱼类神经坏死病毒亲缘关系较远,说明本研究分离得到的XMNNV属于RGNNV基因型。通过超速离心方法对病毒进行提纯,得到了纯化的NNV病毒。电镜观察结果表明,病毒粒子直径20 ~25 nm,结构为正二十面体,与已经报道的NNV结构一致。通过对XMNNV与其它RGNNV RNA2基因进行序列比对,在保守区设计引物,运用R T - P C R方法建立了 RGNNV的PCR检测方法,该方法灵敏度高达67 copies/uL 。纯化的病毒对E11 (条纹月鳢细胞系)和大黄鱼肌肉细胞 进行感染,结果表明该病毒可以感染这两种鱼类细胞。E11细胞被感染病毒后,细胞出现空泡化,并最终导致细胞分解死亡;大黄鱼肌肉细胞感染后,细胞变圆,慢慢从培养皿壁脱落,最终解体死亡。另外,对感染后细胞进行P C R检测,结果显示为阳性,进一步确定了分离的NNV具有感染这两种细胞的能力。本研究通过电镜观察和PCR检测两种方法确定了患病石斑鱼携带NNV,通过对两种鱼类细胞的感染实验,确定了该病毒具有一定的感染能力。综上,本研究为石斑鱼NNV疾病的诊断提供了有效的方法,对石斑鱼NNV疾病的预防具有一定的指导意义。
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4. 闽南地区斜带石斑鱼(Epinephelus coioides ) 神经坏死病毒的基因型与分子进化研究
朱志煌 林克冰 周宸 吴建绍 葛辉 郑乐云 黄种持
   2017, 39 (6): 429-436.  
摘要122)      PDF (3153KB)(751)    收藏
本研究以闽南地区具有典型神经坏死病症状的斜带石斑鱼为材料,采用RT-PCR法对其进行病毒检测,对检测到的阳性序列进行双向测序和构建系统发育树,对病毒颗粒进行分离纯化,并通过分子进化模型分析病毒衣壳蛋白基因所受的选择压力。结果显示,采集到的6个石斑鱼样品均呈NNV 阳性,系统树分析发现6个样品的PCR扩增片段均为RGNNV基因型序列,表明闽南地区感染石斑鱼的神经坏死病毒主要为RGNNV基因型病毒;通过PEG法对病毒进行分离提純,获得直径为25~28 nm、呈二十面立体对称结构的无囊膜病毒 颗粒;分子进化分析显示NNV外壳蛋白基因经历了纯化选择,表明病毒在进化过程中没有 出现遗传变异并以相对恒定保守的速率进化。
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5. 10种免疫相关基因在斜带石斑鱼组织中的表达分析
葛辉 林克冰 周宸 吴建绍 朱志煌 陆振 郑乐云 吴水清 林琪 黄种持
   2017, 39 (5): 379-385.  
摘要120)      PDF (1504KB)(563)    收藏
采用相对实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)技术,以β-肌动蛋白(β-actin)的表达量作为内参,对健康养殖斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)不同组织(头肾、心脏、肝脏、脾脏、鳃、肌肉、鳍、眼、肠道)中的10种免疫相关基因:免疫球蛋白(igM)、CD4、MHCIIa、TCR-β、CD8a、MHCIa、ISP16、Mx、TNFR14、HSP90的mRNA表达量进行了研究。结果显示,10种免疫相关基因在斜带石斑鱼的10种组织中均有表达。其中体液免疫相关基因[免疫球蛋白(IgM)、CD4和MHCIIa]在鳃中的表达量最高,在其他组织部位的表达量相对较少。细胞免疫相关基因(TCR-β、CD8a和MHCIa)也是在鳃中的表达量最高,在眼、肌肉、肝和肠的部位表达量相对较少。ISP16在鳃和肝中的表达量较高,在肌肉和肠中的表达量较低。Mx在鳃中的表达量较高,在肌肉和肠的表达量较低。TNFR14在眼的表达量较高,在肠的表达量较低。HSP90在鳃和肝中的表达量相对较高,在心和肌肉的表达量较低。
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6. 凡纳滨对虾越冬亲虾黑鳃病病症的初步研究
杨求华 杨章武 曹英昆 林琪 陆振 何丽斌 周宸
   2017, 39 (2): 85-89.  
摘要155)      PDF (4623KB)(731)    收藏
为确定越冬凡纳滨对坏亲坏黑總病症病因,对患病亲坏病因进行分析。结果显示,越冬后患病亲虾鳃部观察到大量线虫。虫体特征显微结构显示,雌、雄性线虫的平均体长分别为 (983.6 ±16.69)m 和 (956.9±12.14)m ,虫体表皮不均质,具有2 纵列侧分化、4根头刚毛、3个口腔实齿、5个杯形肛前附器,化感器横向扁椭圆形,食道不形成食道球; 经鉴定,确定该线虫隶属于色矛科(Chromadoridae)、色矛属(Chromadorella)。 组织病理观 察結果表明,线虫感染后亲虾鳃组织坏死、溶解,黑色素沉积,游泳足基部出现黑化层。本文报道了一种由色矛线虫引起的越冬亲虾黑鳃病症。
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7. 南移池塘养殖仿刺参肠道菌群结构分析
杨求华 陆振 林琪 黄瑞芳 何丽斌 葛辉 周宸 杜虹
   2016, 38 (3): 192-201.  
摘要103)      PDF (1515KB)(585)    收藏
本文基于MiSeq高通量测序技术对南移福建池塘养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道菌落结构进行分析。结果表明,仿刺参前肠(1C_1)、中肠(1C_2)和后肠(1C_3)测得的分类操作单元(OTUs)分别为424、444和414;三组样品的菌群物种丰度没有较大差别,但优势菌种存在较大差异;优势菌群方面,后肠的优势菌群为Haliea属和乳球菌属(Lactococcus)(分别占后肠总菌数的11.97%和10.37%),而前肠和中肠的优势菌群均是乳球菌属和芽孢杆菌属(Bacillus),两者在前肠菌落中的占比分别为27.91%和6.08%,在中肠中的占比分别为33.24%和6.97%。在重复性方面,三组样品的菌落组成都有重叠,重叠率为74.35%,其中前肠与中肠相似度较高,菌株种类有90%以上重叠。本文研究为仿刺参肠道益生菌的开发利用提供基础资料。
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8. 基于宏基因组比较分析石斑鱼育苗两种模式水体中的菌群多样性和分布特点
孙敏秋 林克冰 葛辉 黄种持 郑乐云 周宸
   2016, 38 (3): 181-191.  
摘要123)      PDF (2819KB)(665)    收藏
为比较分析石斑鱼育苗新旧模式水体中菌群的分布差异性,研究应用高通量测序技术测定六批次(A1、A2、B1、B2、C1和C2)水样的菌群16S rDNA V4变异区序列,并使用Qiime和Mothur等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)数量,分析物种的丰度、分布和Alpha多样性以及物种丰度的差异性。结果显示,获得用于分析的序列和OTU数为66727/3724 (A1)、66418/3391(A2)、87403/3980(B1)、57519/3438(B2)、62349/3530(C1)和66673/3004(C2);稀疏曲线表明测序深度充分,OTU的数量接近实际情况。A1、A2、B1、B2、C1和C2 六个样品的丰富度指数分别为6 535.21/8 872.16、6 583.85/8 855.40、8 062.60/10 640.49、6 878.85/9 352.25、6 859.85/9 295.45和5 291.87/6 868.28,多样性指数分别为0.05/4.72、0.04/4.77、0.04/4.69、0.04/4.74、0.05/4.45和0.08/4.06。传统模式育苗场暴发石斑鱼病毒性神经坏死病的同一时期,对两种模式育苗水体中的菌群在门、属水平分别进行单样品物种丰度、多样品物种分布和物种丰度差异性分析。在门水平,两种育苗模式育苗水体的优势菌群分布相似,但在属水平,传统模式育苗水体的优势菌群中易致病菌假单胞菌属含量显著高于新模式育苗水体。获得了暴发病毒性神经坏死病前后,石斑鱼育苗新旧两种模式共6批次育苗水样的细菌均匀度、丰富度和菌群结构,推测石斑鱼“生态优化及病害防控人工育苗创新模式”可能有利于抑制致病菌,富集益生菌。
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9. 福鼎硖门湾海区坛紫菜生理性病变的初步研究
吴建绍 葛辉 林克冰 周宸 蔡建堤 杨求华
   2014, 36 (2): 96-101.  
摘要140)      PDF (3748KB)(1034)    收藏
通过对福鼎硖门湾海区坛紫菜病烂情况进行调查、采样和室内培养,运用显微观察方法,研究坛紫菜生理性病变的发生和发展过程。该病主要症状为叶状体梢部颜色逐渐变浅,然后发白、烂化,无明显病灶烂孔;病理表现为叶状体梢部細胞边缘模糊,色素体变色,然后发展为细胞边缘紊乱,细胞溶解,原生质流出,细胞结构失常。病变严重的易引发细菌和原生动物二次感染,造成坛紫菜叶状体出现溃烂,最后完全解离。雨水天气是导致该病变发生的原因,采取剪除叶状体病烂部位和晴好天气延长干出时间是控制该病变的主要措施。
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